PKH26操作说明

PKH26是一种砖利的膜标记探针，结构上带有-长脂肪族尾巴，能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄橙色光谱区间，Zui大激发波长为551nm，Zui大发射波长是567nm ，与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素( Fluorescein)激发滤片，但荧光强度可能会有些降低。PKH26具Zui长的体内半衰期，超过100天。

操作方法：

1、将2×107个细胞于离心管中，用不含血清培养基洗一遍。

2、400×g离心5分钟。

3、离心后，小心吸弃上层清液，剩余上层细 胞液体积不超过25μL。

4、加入1mL稀释液C用移液管轻轻吹打混匀，制备  2×细胞悬液。不要用振荡器震荡，不要让 细胞在稀释液C中保存太长时间。

5、临染色之前，将4μL PKH26 C2H6O溶液加 入1mL稀释液C中，充分混匀，配制的  2×染色液（4×10-6M）。

6、快速将1mL 2×细胞悬液（步骤4）加入  1mL 2×染色液（步骤5）中，立即用移液 管混匀。*终细胞浓度为1×107/mL，PKH26浓度为2×10-6M。

a、不要将PKH26染料直接加入含2×细胞的稀释液C中。

b、在将2×细胞悬液（步骤4）与2×染色液（步骤5）等体积混合。

c、调整2×细胞和2×染料的浓度避免染色 体积太小（＜100μL）或太大（＞5mL）。

d、用电动移液器快速将细胞和染料混匀。 血清移液管混匀速度太慢而使得染色不 均匀。Racking和旋涡震荡混匀同样混匀 较慢，染色均一性较差。

e、分配体积尽量准确，以保Z样品与样品 之间，实验与实验之间的可重复性。

7、混匀后的染色的细胞孵育1-5 min。由于 染色速度较快，延长孵育时间对实验没有帮助。

8、加入等体积的血清（2mL）或其它合适的蛋白溶液（如1% BSA）终止反应，孵育1min以结合多余的染料。

9、将细胞在20-25℃条件下400×g离心10min，小心吸弃上清。用10mL完全培养基重悬，将重悬液转移至另一新的无菌离 心管中，20-25℃条件下400×g离心5 min。用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没 结合的染料。

10、Zui后一步清洗后，用10mL完全培养基重悬细胞评估细胞回收率，细胞活率和荧 光强度（图2。离心重悬细胞至所需活xì bāo浓度。

11、MC-38 TIL细胞用上述zhǐ dìng PKH26浓度染色，Zui终细胞浓度为1×107/ml。活力（▲）由FITC染色测定，平均荧光强度（●）用流式细胞仪检测。用20μM PKH26标记后，抗zhǒng liú TIL 特yì性和效能没有改变。

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